ELISA常用的四种方法

1．直接法测定抗原

将抗原吸附在载体表面；

加酶标抗体,形成抗原-抗体复合物；

加底物.底物的降解量＝抗原量.

2．间接法测定抗体

将抗原吸附于固相载体表面；

加抗体, 形成抗原-抗体复合物；

加酶标抗体；

加底物. 测定底物的降解量＝抗体量.

3．双抗体夹心法测定抗原

将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;

加抗原,形成抗原-抗体复合物;

加抗原免疫第二种动物获得的抗体,形成抗体抗原抗体复合物;

加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体);

加底物.底物的降解量＝抗原量.

4. 竞争法测定抗原

将抗体吸附在固相载体表面;

(1) 加进酶标抗原；

(2),(3)加进酶标抗原和待测抗原；

加底物.对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量.

三．仪器和材料

1. 聚苯乙烯微量细胞培养板(平板, 40, 96孔).

2. 酶联免疫检测仪

3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀释度1:1000.

4. 包被液:：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃,保存, Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml.

5. 稀释液：0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween--20, ４℃,保存. NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween-20,0.5ml. 蒸馏水加至1000ml.

6. 洗涤液：同稀释液

7. 封闭液：0.5%鸡卵清蛋白,pH7.4 PBS.

8. 邻苯二胺溶液(底物)：临用前配制 0.1M 柠檬酸(2.1g/100ml), 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O (7.163g/100ml) 6.4ml, 蒸馏水12.5ml, 邻苯二胺10mg, 溶解后, 临用前加30%H2O2 40 微升.

9. 终止液：2mol/LH2SO4.

四. 操纵步骤

1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1～10微克/孔,每孔加200微升,37℃温育1小时后,4℃冰箱放置16～18小时.

2. 洗涤：倒尽板孔中液体,加满洗涤液,静放三分钟,反复三次,最后将反应板颠倒在吸水纸上,使孔中洗涤液流尽.

3. 加封闭液200微升,37℃放置一小时.

4. 洗涤同2.

5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,,每孔200微升.同时作稀释液对照.37℃放置2小时.

6. 洗涤同2.

7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃ 1小时.

8. 洗涤同2.

9. 加底物：邻苯二胺溶液加200ml,室温暗处10--15分钟.

10. 加终止液：每孔50微升.

11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录450nm读数.

1．直接法测定抗原

将抗原吸附在载体表面；

加酶标抗体,形成抗原-抗体复合物；

加底物.底物的降解量＝抗原量.

2．间接法测定抗体

将抗原吸附于固相载体表面；

加抗体, 形成抗原-抗体复合物；

加酶标抗体；

加底物. 测定底物的降解量＝抗体量.

3．双抗体夹心法测定抗原

将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;

加抗原,形成抗原-抗体复合物;

加抗原免疫第二种动物获得的抗体,形成抗体抗原抗体复合物;

加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体);

加底物.底物的降解量＝抗原量.

4. 竞争法测定抗原

将抗体吸附在固相载体表面;

(1) 加进酶标抗原；

(2),(3)加进酶标抗原和待测抗原；

加底物.对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量.

三．仪器和材料

1. 聚苯乙烯微量细胞培养板(平板, 40, 96孔).

2. 酶联免疫检测仪

3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀释度1:1000.

4. 包被液:：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃,保存, Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml.

5. 稀释液：0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween--20, ４℃,保存. NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween-20,0.5ml. 蒸馏水加至1000ml.

6. 洗涤液：同稀释液

7. 封闭液：0.5%鸡卵清蛋白,pH7.4 PBS.

8. 邻苯二胺溶液(底物)：临用前配制 0.1M 柠檬酸(2.1g/100ml), 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O (7.163g/100ml) 6.4ml, 蒸馏水12.5ml, 邻苯二胺10mg, 溶解后, 临用前加30%H2O2 40 微升.

9. 终止液：2mol/LH2SO4.

四. 操纵步骤

1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1～10微克/孔,每孔加200微升,37℃温育1小时后,4℃冰箱放置16～18小时.

2. 洗涤：倒尽板孔中液体,加满洗涤液,静放三分钟,反复三次,最后将反应板颠倒在吸水纸上,使孔中洗涤液流尽.

3. 加封闭液200微升,37℃放置一小时.

4. 洗涤同2.

5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,,每孔200微升.同时作稀释液对照.37℃放置2小时.

6. 洗涤同2.

7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃ 1小时.

8. 洗涤同2.

9. 加底物：邻苯二胺溶液加200ml,室温暗处10--15分钟.

10. 加终止液：每孔50微升.

11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录450nm读数.