Western Blot，通常我们在日常交流中说的就是简称“WB”，中文名称是“蛋白印迹”或“免疫印迹”，其核心本质是抗原抗体的特异性反应。Western Blot的基本原理是蛋白质通过凝胶电泳后，按分子量大小顺序在分离胶中分离开来，通过转膜可将胶上蛋白质转移到固相载体（通常是PVDF膜、NC膜和尼龙膜）表面，然后加入一抗去特异性结合膜上蛋白质，再加入酶或者荧光素标记的二抗，二抗与一抗结合反应后，通过底物显色、化学发光等方法检测目的蛋白。Western Blot实验一般用来判断特定蛋白在样本中是否表达及粗略分析特定蛋白表达量的高低。

Western Blot是实验室中常见且重要的一种分子生物学实验方法，一次完整的实验一般需要两天时间，当我们对实验结果满怀期待or充满信心，也许现实会给我们一记响亮的耳光。

                                                              /   条 带 弱   / 

原因分析1：抗原量不足；

解决方案1：上样前做蛋白定量，增大上样量；

蛋白定量的意义：保证各处理组总蛋白上样量一致,蛋白总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴定，蛋白含量太高会使条带扭曲，影响电泳的分辨力；

原因分析2：蛋白质储存过程中降解；

解决方案2：重新制备样品；

原因分析3：膜错误选择，转膜不完全；

解决方案3：选择合适的转印膜：大蛋白（＞20KDa）选大孔膜（0.45μm），小蛋白（＜20KDa）选小孔膜（0.2μm）；优化转膜条件、时间、电压。

转膜中的要点和建议

原因分析4：抗体量不足；

解决方案4：增加抗体浓度，注意抗体储存条件（避免反复冻融）；

抗体的保存和使用：

1 收到抗体后按要求离心后再打开管盖进行分装盒保存；

2 对于大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在-20℃

    2.1 分装的量以一次实验用为好，最好不能少于10ul每份，因为分装体积越小，抗体的浓度越可能受到蒸发及管壁吸附的影响；

    2.2 复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在4℃，避免再冻起来；

3 大部分抗体收到后4℃短暂保存1-2周对抗体活性是没有影响的。

任何时候，绝对避免反复冻融。

原因分析5：抗体孵育时间不足；

解决方案5：建议一抗4度孵育过夜；相对于2小时孵育，一抗4度过夜孵育会显著增加抗体的结合。