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技术支持
培养细胞染色体显示法

1)  传代培养细胞染色体显示法
1.培养细胞:取处于指数生长期、用较大瓶皿培养的、80%~90%汇合单层培养细胞。
2.加秋水仙素:使用最终浓度为0.02~0.8微克/毫升营养液,温箱继续培养6~10小时;或用低温封闭法:把培养细胞置于4℃条件下6~12小时后,再于37℃温箱继续培养6~10小时处理(加秋水仙素)。
3.采集分裂细胞:可利用分裂中期细胞体变圆与底物附着不牢特点,此时手持培养瓶,左右反复横向水平摇动,令培养液在培养细胞表面反复冲刷。应用此法可使90%的中期分裂细胞从瓶壁脱落,注意勿用力过猛,以防多量非分裂细胞脱落影响观察。
4.离心:收集培养液,1000转/分钟离心5~10分钟。
5.低渗处理:吸除上清液、加入预温至37℃的0.075M KCl溶液,在温箱中静置20~30分钟。
6.预固定:向悬液中加新鲜1:3醋酸、甲醇固定液1ml,用吸管吹打调匀,此措施能起到先使细胞表面轻微固定,可防止固定后细胞粘连成块。
7.固定:离心,同4,吸除上清液,加新鲜固定剂5~10ml;加固定剂时要用一手微斜持离心管,另手用吸管吸取固定剂,把固定剂逐滴滴在离心管壁上,使之慢慢流入离心管中,然后轻轻吹打均匀,置15~20分钟。
8.重复7,末次离心后,小心吸除大部分上清,据悬液中细胞密度大小,余下固定液0.5~1ml。
9.制片:用滴片法制片,按如下步骤:彻底洗净载物片,勿留任何油脂,置冰箱中储备备用。滴片前现从冰箱中取出冷载物片1片,在载物片表面出现细微水气时,立即向片的一侧滴2~3滴细胞悬液,滴片时的距离能保持半米高度才好。滴片后置室温中令其自然干燥,或用吹风机热风吹干亦可。如此制备好的标本可置盒中备用或立即进行染色观察。
10.  染色和封片:一般常用Giemsa染色:取干液Giemsa 1份加pH6.8磷酸缓冲液9份混合,染色10分钟后,水洗、晾干、可直接观察。如标本需要保存或做长时间观察,可过二甲苯两次后,用中性树胶封片后,再过二甲苯,然后封片亦可。

2)  人末梢血微量全血培养染色体显示法
1.培养液准备:取15ml培养瓶数个,每瓶内分别充入5ml培养液(pH 7.2),内含:1640培养液(含10%~15%小牛血清),PHA 0.1ml,青霉素100单位和链霉素100微克/毫升 培养液
2.抽血针管准备:取2~5ml针管一支,在消毒后的无菌操作台或无菌操作箱中安装好注射器,无菌抽肝素(100 U/ml BBS)少许湿润针管,如动作迅速不用肝素亦可。
3.采血:用棉签75%酒精给患者或献血者的皮肤消毒两次,缚止血带,静脉取血1~2ml。无菌操作迅速向每一瓶培养中加血0.4~0.5ml,如系外出采血,安装针管及分装血液两步骤亦可在无菌条件略差的环境内操作,但动作要迅速,以减少污染;在采血量不多或不应抽血的情况下,亦可在耳垂、手指肚(无名指)用刺血针采血。
4.培养和加秋水仙素:37℃温箱中培养到60~72小时之间,此时细胞分裂相最多,向每培养瓶内加秋水仙素,最终浓度0.02~0.08微克/毫升营养液,再培养4~6小时。
5.低渗:1000转/分钟离心10分钟,吸除上清液,加入预温过的0.075M KCl溶液10ml,置温箱中低渗处理15~20分钟。
6.其余步骤与处理传代细胞法相同。

3)  羊水细胞培养
1.抽取羊水:无菌抽取羊水10~20ml,立即注入无菌离心管中。
2.离心分离:1000转/分离心10分钟,去上清,留0.5ml。
3.培养:加培养液4ml(含小牛血清1ml),用NaHCO3调pH至6.8,置37℃培养,在温箱培养7~10天后,可见大量成纤维细胞或上皮样细胞生长;加秋水仙素0.02~0.8微克/毫升营养液,作用10~12小时。
4.其余步骤与传代细胞培养染色体制备法相同。
 

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