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技术支持
染色体结构显示和检测

1)  染色体显带
显Q带法
1.      漂洗:取经过干热预处理或已老化的染色体标本,置于pH6.0缓冲液中浸5~10分钟。
2.      染色:浸入pH6.0的GM或QD染液中5~10分钟。 
3.      漂洗:浸入新鲜pH6.0缓冲液中漂洗两次,每次5分钟。
4.      观察:向标本染色体面滴1~2滴新鲜缓冲液,覆以盖片(避免出气泡),置荧光显微镜下观察。

显G带法
胰酶-Giemsa混合显带法
1.预处理:取中期染色体标本,置60℃~60℃温箱中20~30分钟,或在37℃温箱过夜,然后浸入0.025M磷酸缓冲液中,pH6.8,56℃温浴10分钟。
2.消化和染色:用现配制的胰蛋白酶-Giemsa混合液消化和染色10~30分钟,混合液按如下比例配制:
0.025 M 磷酸缓冲液pH6.8           73.0 ml
甲醇                                 27.0 ml
Giemsa干粉                          50.0 mg
0.25%胰酶                           0.3~0.4 ml
3.封片:染色后用自来水冲洗,入蒸馏水漂洗数次、晾干、二甲苯透明2~3分钟,封入中性树脂中。

Giemsa显带法
1.预处理:将标本置入60~80℃温箱或烤箱中20~30分钟,亦可在37℃温箱过夜。
2.胰酶消化:用0.85%的NaCl配制0.25%胰蛋白酶溶液消化3~5分钟。
3.染色:取出标本片,先直立于吸水纸上除去多余胰酶液后,随即置入Giemsa染液中,染10分钟。
4.封片:自来水洗,蒸馏水漂洗,晾干,二甲苯透明2~3分钟,封入中性树胶中。

2)  姐妹染色单体分化染色
BUdR掺入和制片程序
1.BUdR培养液制备:先制备好含BUdR的培养液(最终浓度为3~10微克/毫升)。
2.BUdR掺入:如用传代细胞,在末次传代后,改换用含BUdR的培养液培养。如为人末梢血细胞,一开始就用含BUdR培养液培养(培养瓶放在特制黑色木盒、黑布中或黑纸包裹)37℃温箱内培养。
3.中止掺入与制片:待细胞经历两个细胞周期(人周围血细胞培养48或72小时)
4.加秋水仙素—制片。

姐妹染色单体分化染色
方法一
1.老化:中期染色体标本老化1~2天。
2.预处理:放入预热至85~89℃的1 M NaH2PO4处理15分钟。
3.制片:然后用温蒸馏水轻轻漂洗,蒸馏水冲洗,晾干,Giemsa液染色10分钟,晾干,二甲苯透明,封固。

方法二:即FPG法
1.标本:掺入BUdR后的中期染色体标本。
2.荧光染色:用荧光染料Hoechst 33258(用pH7.0 Sorensen缓冲液配制,浓度为0.5微克/毫升)染色12~15分钟。
3.黑光灯照射:自来水冲洗,加1滴pH8.0 缓冲液,覆以盖片,用黑光灯照射(20 W),距离5厘米,时间半小时。
4.温浴:50~60℃热的2×SSC液温育2小时,蒸馏水冲洗,晾干。
5.染色:pH6.8的2%Giemsa染色15分钟,透明封固。

方法三
1.标本:掺入BUdR后的中期染色体标本,置30瓦日光灯下,灯距3厘米,照射6小时。
2.温浴:用2×SSC液(60℃)处理15分钟。
3.Giemsa染色10分钟,也可获得满意的标本。

3)  染色体脆性位点的检测
为提高检出率,可采取以下措施:
1.在培养时把血清量降到5%。
2.用不含叶酸的MEM-Fra培养基培养。
3.PH调至7.5。

4)  微核检测
方法一:
1.采血:静脉采血0.5ml,肝素抗凝,用小方瓶培养,加培养液5ml。培养液租成为:含20%小牛血清的Eagle液,加PHA 40微克/毫升。
2.培养:置37℃温箱内培养48或72小时,以1000rpm离心8分钟。
3.固定:3:1甲醇/冰醋酸固定3次,每次15分钟,离心沉淀固定液。
4.制片:冷冻载片滴片法制片,自然干燥,10%Giemsa(pH6.8)染色15分钟。

方法二
1.采血:肝素抗凝血0.5~0.6ml,置10ml试管中,加入血量一半的0.5%甲基纤维素,充分混合。
2.培养:置37℃温箱中静置培养30分钟,以2000rpm离心10分钟,去上清液。
3.制片:做涂片,Wright法染色。

方法三
1.采血:用三棱针刺无名指取血0.6ml,立即注入内径3mm,长5cm的血液沉淀管中,用小玻璃棒搅拌除去纤维蛋白。
2.加明胶:加入3%的明胶,小心混匀,置37℃温箱自然沉降50分钟。
3.吸去上清液,离心,沉淀物涂片,自然干燥,Wright染色30分钟,再用Giemsa染色2分钟。

5)  非程序DNA合成检测(UDS)
放射自显影UDS的测定:
1.细胞培养:WI-38成纤维细胞,完全培养液支持物盖片培养法培养,细胞生长至汇合时。
2.抑制DNA合成:弃旧培养液,加入不含精氨酸的EMEM培养液,继续培养20~24小时。
3.加测试物:加入10mM羟基脲(阳性对照加MNNG),培养2小时。
4.H-TdR处理:2、3、4每皿内加3H-TdR后,培养20~24小时。
5.漂洗:去除培养液,用不含钙、镁BSS漂洗。
6.制片:制备放射自显影标本方法固定细胞、涂胶、曝光、显影及染色。
7.观察:在油镜下计数,首先要排除S期半保留复制细胞(为银粒覆盖的细胞核),只计数核上的银粒数目,再扣除本底,结果以银粒数/核的均值或含10个银粒左右细胞的百分率表示。

液闪计数法:
1.细胞培养和处理:人二倍体成纤维细胞:接种在培养皿中培养。
2.加培养液、MNNG、羟基脲,以及3H-TdR处理等于前5项相同。自(5)漂洗后。
3.消化:用0.25%胰蛋白酶消化,制成悬液。
4.液闪计数标本制备:10%三氯醋酸处理,将细胞收集在玻璃纤维滤纸片上,无水乙醇脱水烤干,置液闪杯中,加闪烁液,置液闪计数仪上计数。结果以dpm/106细胞或cpm/每皿细胞表示。

 

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